Exercício Colaborativo SPInDel 2014

O presente exercício fornecerá aos laboratórios participantes um mix de primers necessário para realizar a genotipagem de todas as amostras incluídas no Exercício Intercomparação 2014. O mix inclui primers para amplificação por PCR de 6 regiões do DNA mitocondrial (mtDNA) ricas em polimorfismos de inserção/deleção (indels) que originam perfis de tamanhos únicos para as seguintes espécies de mamíferos: homem (Homo sapiens), gato (Felis catus), cão (Canis familiaris), vaca (Bos taurus), cabra (Capra hircus), ovelha (Ovis aries), porco (Sus scrofa), coelho (Oryctolagus cuniculus), cavalo (Equus caballus) e rato (Mus musculus). No entanto, perfis únicos podem ser obtidos para outras espécies como explicado na referência Pereira et al., 2010.

O método de genotipagem das amostras é simples e semelhante ao realizado para STRs, compreendendo uma única PCR multiplex seguida de eletroforese capilar.

O trabalho de laboratório compreende as seguintes fases:

PCR multiplex. Amplificam-se os 6 marcadores (denominados SPID) numa única reação de PCR usando o mix de primers fornecido. O mix de primers encontra-se otimizado para se obter produtos de reação equilibrados seguindo o protocolo indicado. O protocolo original utiliza a master mix de amplificação “QIAGEN Multiplex PCR Kit”.
Separação eletroforética dos fragmentos amplificados. A realizar em sequenciador capilar do tipo “ABI Genetic Analyzer” (310, 3100, 3130, 3500, 3730 ou variantes equivalentes). O protocolo original utiliza POP7 como polímero de separação (alternativamente, poderão ser usados POP6 ou POP4, sempre tendo em atenção as consequentes alterações de mobilidade eletroforética).

O perfil resultante de um processamento adequado da amostra deverá resultar num eletroforegrama semelhante aos mostrados na figura:

Aos laboratórios participantes serão enviados 100 µL de um mix de primers de PCR para processamento de aproximadamente 100 reações. A mistura contém os pares de primers marcados com fluorescência (6-FAM) necessários para a coamplificação dos 6 marcadores. Quaisquer outros materiais ou reagentes necessários para o estudo deverão ser obtidos pelo laboratório participante.

Para informações adicionais ou esclarecimento de dúvidas sobre o protocolo da reação e leitura dos perfis genéticos deverá ser contactado Filipe Pereira (via correio eletrónico fpereirapt@gmail.com). A solicitação de ficheiros modelo de “panels” e “bins” para importar no programa de análise (por exemplo GeneMapper) incluindo suporte para o seu ajustamento à mobilidade própria de cada aparelho) poderá ser feita através do mesmo contacto.

Após a genotipagem, a classificação das amostras em termos de determinação da espécie poderá ser concretizada através da plataforma SPInDel, disponível em http://www.portugene.com/SPInDel/SPInDel_web.html. O programa inclui uma base de dados com as sequências de referência de mtDNA e os perfis numéricos obtidos com os marcadores SPID.

Os resultados obtidos deverão ser enviados até um mês após a data limite de envio de resultados do Exercício Intercomparação 2014. Os resultados deverão ser enviados indicando o perfil obtido (em formato que será posteriormente divulgado), acompanhado pelos electroforegramas obtidos em formato pdf.

É conveniente guardar os arquivos .fsa e/ou os eletroforegramas relativos a todas as corridas realizadas uma vez que poderão ser necessários para esclarecer dúvidas que possam surgir.

Requisitos dos participantes

O responsável deverá obrigatoriamente ser membro do GHEP e ter as quotas em dia.
O pagamento de uma quota de participação no valor de 50 euros no termo estabelecido (online ou por transferência bancária, como descrito em http://www.gep-isfg.org/ISFG/Portugues/Controle_de_qualidade/formas_pago.php).

Prazos

Data limite de inscrição: 31 de Dezembro de 2013

Data limite de pagamento: 7 de Fevereiro de 2014

Data limite de envio de resultados: um mês após a data limite de envio de resultados do Exercício Intercomparação 2014

Contactos

Filipe Pereira (CIIMAR, Porto, Portugal): fpereirapt@gmail.com

António Amorim (IPATIMUP, Porto, Portugal): aamorim@ipatimup.pt

Cíntia Alves (IPATIMUP, Porto, Portugal): calves@ipatimup.pt

Referências:

Pereira F, Carneiro J, Matthiesen R, van Asch B, Pinto N, Gusmão L, Amorim A. Identification of species by multiplex analysis of variable-length sequences. Nucleic Acids Res. 2010 Dec;38(22):e203.

Carneiro J, Pereira F, Amorim A. SPInDel: a multifunctional workbench for species identification using insertion/deletion variants. Mol Ecol Resour. 2012 12(6):1190-5.