Determinação Molecular do Sexo utilizando Amplificação Isotérmica à Base de LAMP
Introdução:
A determinação do sexo em amostras biológicas humanas é parte fundamental da casuística forense, principalmente naquelas que envolvem agressão sexual. Kits comerciais baseados em PCR multiplex que geralmente incluem o gene da amelogenina (AMEL) são comumente usados, embora inconsistências tenham sido relatadas em algumas populações devido a deleções neste local.
A amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP: Loop-Mediated DNA Amplification) é uma técnica de amplificação de DNA versátil, com maior eficiência, especificidade e rendimento em comparação com a PCR convencional. O procedimento em si é simples do ponto de vista experimental, pois trata-se de uma reação isotérmica mediada pela DNA polimerase Bst que permite a síntese contínua de cópias de DNA por autodeslocamento da cadeia, o que aumenta sua sensibilidade e evita a necessidade de equipamentos que realizem ciclos temperados. Os produtos de amplificação podem ser detetados por eletroforese de agarose, análise de turbidez, bem como por simples visão usando corantes sensíveis ao pH.
A presente proposta baseia-se na avaliação de um protocolo LAMP multiplex para a deteção de diferentes marcadores específicos e incomuns (TSPY3, TTTY2, TTTY7) do cromossoma Y humano em combinação com a primeira região intrónica do gene AMEL. O nosso sistema usa um conjunto de 6-8 primers para cada alvo, projetado para melhorar a sensibilidade e a especificidade, reduzindo o tempo de deteção para apenas 45 minutos.
Misturas controladas de DNA humano masculino e feminino simulando amostras forenses serão testadas em diferentes proporções, bem como níveis de sensibilidade em diluições de DNA masculino e especificidade contra espécies domésticas comumente encontradas em contextos forenses.
Objectivos:
1.- Divulgar o uso e diversas aplicações da técnica LAMP.
2.- Avaliar o desempenho do método LAMP para a determinação molecular do sexo em humanos, limites de especificidade e sensibilidade incluindo misturas, com amostras controladas que simulam um contexto forense.
3.- Recolher ideias sobre a potencial aplicação da técnica LAMP de diferentes laboratórios com experiência forense comprovada.
Metodologia:
Os laboratórios interessados podem registar o seu interesse em participar, preenchendo os seus dados e autorização para serem contatados pelos coordenadores do exercício, no seguinte formulário online:
Os laboratórios participantes receberão uma mistura suficiente de primers e amostras cegas para os diferentes contextos (misturas, diluição de DNA masculino, DNA de animais domésticos).
A New England Biolabs fornecerá o Mix colorimétrico 2X WarmStart LAMP para realizar pelo menos 50 reações (15 μl), o suficiente para testar cada item em triplicado, e mesmo com algum excesso para testar as próprias amostras de referência. Os resultados das reações devem ser registados fotograficamente e o formato dos resultados deve ser preenchido e enviado aos laboratórios participantes para o efeito.
Se forem necessárias informações adicionais ou esclarecimento de dúvidas sobre o protocolo experimental, Germán Burgos deve ser contactado por e-mail (ver final do documento).
Os coordenadores irão compilar os resultados e emitir um relatório preliminar para comunicar o conjunto de conclusões durante as Jornadas GHEP 2023. Uma vez discutidos os resultados, será redigida a versão final da comunicação científica relevante.
Requisitos para participantes:
• Ser sócio do GHEP-ISFG e estar em dia com o pagamento das suas cotas.
• Uma cota de participação de 50 euros deve ser paga dentro do prazo estabelecido.
Prazos:
Prazo de inscrição: 30 de novembro de 2022
Prazo de pagamento: 7 de fevereiro de 2023
Data limite para envio dos resultados: 28 de junho de 2023
Apresentação dos resultados: 26 a 28 de julho de 2023 durante a XXVIII Jornadas do GHEP-ISFG (Cartagena-Colômbia)
Notas:
A New England Biolabs, fabricante do mix colorimétrico LAMP apoia esta iniciativa, utilizando os seus canais de distribuição em vários países para fornecer o mix gratuitamente, inclusivé para 30 laboratórios participantes.
Os registos fotográficos das reações, distribuídos espacialmente de acordo com um modelo padrão, e eventualmente os registos da eletroforese de agarose 2% (para os participantes que decidirem realizá-las) devem ser enviados como comprovativo dos resultados e/ou para resolver quaisquer dúvidas que possam surgir.
Para a publicação dos resultados, é estabelecido o limite de um autor por cada laboratório registado, que será classificado por ordem alfabética, incluindo os organizadores.
Coordenadores e contactos:
Germán Burgos Figueroa, Universidade das Américas, Quito, Equador: hgermanburgosf@yahoo.com, german.burgos@udla.edu.ec
Leonor Gusmão, UERJ, Rio de Janeiro, Brasil: leonorbgusmao@gmail.com
Jacobus de Ward, Universidade das Américas, Quito, Equador: jacobusdeward@gmail.com
Para saber mais….
Partilhamos o seguinte link, o proceeding que publicámos na FSIGSS, onde descrevemos detalhadamente os nossos resultados, para informações adicionais contactar o GBurgos via email.
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1875176822000853
LAMP Video Tutorial: https://international.neb.com/tools-and-resources/video-library/loop-mediated-isothermal-amplification-lamp-tutorial?autoplay=1 © Copyright 2022 New England Biolabs. Todos os direitos reservados.