Determinación Molecular de Sexo Mediante Amplificación Isotérmica Basada en LAMP
Introducción:
La determinación del sexo en muestras biológicas humanas es parte fundamental en la casuística forense especialmente en los que implican agresión sexual. Por lo general se utilizan kits comerciales basados en PCR múltiplex que incluyen comúnmente al gen de la amelogenina (AMEL), aunque se han informado inconsistencias en algunas poblaciones debido a deleciones en este sitio.
La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP: Loop-Mediated DNA Amplification) es una técnica de amplificación de ADN versátil, con mayor eficiencia, especificidad y rendimiento respecto a la PCR convencional. El procedimiento en sí mismo es simple desde el punto de vista experimental ya que se trata de una reacción isotérmica mediada por la ADN polimerasa Bst que permite la síntesis continua de copias de ADN mediante auto desplazamiento de cadena, lo que aumenta su sensibilidad y evita la necesitad de equipos que realicen ciclos temperados. Los productos de amplificación pueden detectarse mediante electroforesis en agarosa, análisis de turbidez, así como a simple vista utilizando colorantes sensibles al pH.
La presente propuesta radica en la evaluación de un protocolo LAMP múltiplex para la detección de diferentes marcadores específicos, no habituales (TSPY3, TTTY2, TTTY7) del cromosoma Y humano en combinación con la primera región intrónica del gen AMEL. Nuestro sistema utiliza un conjunto de 6-8 primers para cada target, diseñados para mejorar la sensibilidad y especificidad, reduciendo el tiempo de detección a solo 45 minutos.
Se evaluarán mezclas controladas de ADN humano femenino y masculino que simulen muestras forenses en diferentes proporciones, al igual que los niveles de sensibilidad en diluciones de ADN masculino y la especificidad contra especies domésticas comúnmente encontradas en contextos forenses.
Objetivos:
1.- Difundir el uso y las diversas aplicaciones de la técnica LAMP.
2.- Evaluar el desempeño del método LAMP para la determinación molecular de sexo en humanos, especificidad y límites de sensibilidad incluyendo mezclas, con muestras controladas que simulen un contexto forense.
3.- Recabar ideas sobre la potencialidad de aplicación de la técnica LAMP desde diferentes laboratorios con experticia forense probada.
Metodología:
Los laboratorios interesados pueden consignar su interés en participar diligenciando sus datos y autorización para ser contactados por los coordinadores del ejercicio en el siguiente formulario online:
Los laboratorios participantes recibirán de nuestra parte suficiente mezcla de primers y muestras ciegas para los diferentes contextos (mezclas, dilución ADN masculino, ADN de animales domésticos).
New England Biolabs proveerá la Mix 2X WarmStart LAMP colorimétrica para llevar a cabo al menos 50 reacciones (15 μl), suficiente para evaluar cada ítem por triplicado, e incluso con cierto exceso para evaluar muestras de referencia propias. Se debe registrar fotográficamente el resultado final de las reacciones, y diligenciar el formato de resultados que se diseñará para tal fin.
Si se necesita información complementaria o aclaración de dudas respecto al protocolo experimental se debe contactar a Germán Burgos vía email (ver final del documento)
Los coordinadores recopilaremos los resultados y emitiremos un informe preliminar para comunicar el conjunto de hallazgos durante las jornadas GHEP 2023, una vez realizada la discusión de resultados se redactará la versión final de la comunicación científica pertinente.
Requisitos para los participantes:
- Ser socios del GHEP-ISFG y estar al día en sus cuotas de mantenimiento.
- Se debe abonar una cuota de participación de 50 euros en el plazo establecido
Plazos
Fecha límite de inscripción: 30 de noviembre 2022
Fecha límite de pago: 7 de febrero 2023
Fecha límite para el envío de los resultados: 28 de junio de 2023
Presentación de resultados: 26 al 28 de julio de 2023 durante las XXVIII Jornadas del GHEP (Cartagena-Colombia)
Notas:
New England Biolabs, fabricante de la mix colorimétrica LAMP brinda su apoyo a esta iniciativa utilizando sus canales de distribución en diversos países para proporcionar la mix de forma gratuita, incluso para 30 laboratorios participantes.
Los registros fotográficos de las reacciones, distribuidos espacialmente según una plantilla estándar, y eventualmente los registros de las electroforesis en agarosa al 2% (para aquellos participantes que decidan realizarlas) deben enviarse como evidencia de los resultados y/o para resolver dudas que se puedan presentar.
Para la publicación de resultados, se establece un límite de un autor por cada laboratorio inscrito, que serán clasificados por orden alfabético, se incluirá a los organizadores.
Coordinadores y contactos:
Germán Burgos Figueroa, Universidad de Las Américas, Quito, Ecuador: hgermanburgosf@yahoo.com, german.burgos@udla.edu.ec
Leonor Gusmão, UERJ, Rio de Janeiro, Brazil: leonorbgusmao@gmail.com
Jacobus de Ward, Universidad de Las Américas, Quito, Ecuador: jacobusdeward@gmail.com
Para conocer más...
Les compartimos el el siguiente link, el proceeding que hemos publicado en FSSIGSS, en donde describimos detalladamente nuestros resultados, para información adicional contactar via email a GBurgos.
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1875176822000853
Video tutorial LAMP: https://international.neb.com/tools-and-resources/video-library/loop-mediated-isothermal-amplification-lamp-tutorial?autoplay=1 © Copyright 2022 New England Biolabs. All Rights Reserved.