Non-human genetics
En este ejercicio se proporcionará a los laboratorios participantes una mix de primers para llevar a cabo el genotipado de las muestras incluidas en el Ejercicio Intercomparación GHEP 2014. La mezcla incluye primers para la amplificación por PCR de seis regiones del ADN mitocondrial (ADNmt) rico en polimorfismos de inserción/deleción (indels) que originan perfiles de tamaños únicos para las siguientes especies de mamíferos: humano (Homo sapiens), gato (Felis catus) ,perro (Canis familiaris) ,vaca (Bos taurus), cabra (Capra hircus), ovejas (Ovis aries), cerdo (Sus scrofa), conejo (Oryctolagus cuniculus ), caballo (Equus caballus ) y el ratón (Mus musculus). Sin embargo, los perfiles únicos se pueden obtener de otras especies como se explica en la referencia Pereira et al., 2010.
El método para el genotipado de la muestra es simple y similar al realizado para los STRs. Comprende un único paso de PCR en múltiplex seguido por electroforesis capilar.
El trabajo de laboratorio consta de las siguientes etapas:
1. PCR Multiplex. Se amplifican 6 marcadores (llamados SPID) en una única reacción de PCR usando la mix de primers proporcionada. La mix de primers se encuentra optimizada para obtener productos de reacción equilibrados siguiendo el protocolo indicado. El protocolo original utiliza la master mix de amplificación “QIAGEN Multiplex PCR Kit”.
2. Separación electroforética de los fragmentos amplificados. A realizar en un secuenciador capilar tipo “ABI Genetic Analyzer” (310, 3100, 3130, 3500, 3730 o variantes equivalentes). El protocolo original utiliza POP7 como polímero de separación (alternativamente se podrán usar POP6 o POP4, siempre teniendo en cuenta las consecuentes alteraciones de movilidad electroforética).
El perfil resultante tras un proceso de análisis adecuado debe dar lugar a eletroforegramas similares a los mostrados en la imagen:
A los laboratorios participantes se les enviarán 100 µL de una mezcla de primers de PCR para llevar a cabo aproximadamente 100 reacciones. La mezcla contiene pares de primers marcados con fluorescencia (6-FAM) necesarios para la co-amplificación de los 6 marcadores. El resto de materiales o reactivos necesarios para el estudio deberán ser aportados por el propio laboratorio participante.
Si se necesita información complementaria o aclaración de dudas respecto al protocolo de análisis y lectura de los perfiles genéticos, debe contactarse con Filipe Pereira (vía e-mail: fpereirapt@gmail.com). El envío de archivos template de “paneles” y “bins” para importar en el programa de análisis (por ejemplo GeneMapper), incluyendo el soporte para su ajuste a la movilidad propia de cada aparato, se hará mediante solicitud al mismo correo.
Después del genotipaje, la clasificación de las muestras en cuanto a la determinación de las especies se puede realizar a través de la plataforma SPInDel, disponible en http://www.portugene.com/SPInDel/SPInDel_web.html. El programa incluye una base de datos que contiene las secuencias de referencia de ADNmt y perfiles numéricos obtenidos con marcadores SPID.
Los resultados deberán enviarse hasta un mes después de la fecha límite de envío de resultados del Ejercicio Intercomparación GHEP 2014. Los resultados deben ser enviados indicando el perfil obtenido (en formato que se describirá posteriormente), acompañado por los electroforegramas obtenidos en formato pdf.
Se recomienda guardar los archivos .fsa y/o los electroferogramas de todas las carreras electroforéticas realizadas ya que los mismos pueden ser necesarios para aclarar dudas que puedan surgir.
Requisitos de los participantes
- Los participantes deberán ser obligatoriamente socios del GHEP-ISFG y estar al corriente de pagos.
- Se debe abonar una cuota de participación de 50 euros en el plazo establecido (on-line con tarjeta de crédito o mediante transferencia bancaria según se describe en http://www.gep-isfg.org/es/control-calidad/formas-pago.html).
Plazos
Fecha límite de inscripción: 31 de diciembre 2013
Fecha límite de pago: 7 de febrero 2014
Fecha límite para el envío de los resultados: un mes después de la fecha límite de envío de resultados del Ejercicio Intercomparación GHEP 2014
Contactos
Filipe Pereira (CIIMAR, Porto, Portugal): fpereirapt@gmail.com
António Amorim (IPATIMUP, Porto, Portugal): aamorim@ipatimup.pt
Cíntia Alves (IPATIMUP, Porto, Portugal): calves@ipatimup.pt
Referencias:
Pereira F, Carneiro J, Matthiesen R, van Asch B, Pinto N, Gusmão L, Amorim A. Identification of species by multiplex analysis of variable-length sequences. Nucleic Acids Res. 2010 Dec;38(22):e203.
Carneiro J, Pereira F, Amorim A. SPInDel: a multifunctional workbench for species identification using insertion/deletion variants. Mol Ecol Resour. 2012 12(6):1190-5.